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【應(yīng)用】使用C-950雙模式高效分離蛋清蛋白

步琦 2025-10-21 | 閱讀：218

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使用 C-950 雙模式

高效分離蛋清蛋白

Pure應(yīng)用

簡介

蛋白質(zhì)在生物系統(tǒng)中起著至關(guān)重要的作用，參與生命所必需的各種代謝過程。由于它們的重要性，它們被廣泛應(yīng)用于制藥等行業(yè)，在這些行業(yè)中，它們有助于藥物開發(fā)（例如抗生素和生物制藥），以及食品生產(chǎn)，在這些行業(yè)中，它們作為營養(yǎng)補(bǔ)充劑的關(guān)鍵成分。鑒于它們在健康相關(guān)應(yīng)用中的預(yù)期用途，在蛋白質(zhì)提取過程中實(shí)現(xiàn)高純度是至關(guān)重要的。

在各種可用的純化方法中，色譜法因其在分離蛋白質(zhì)方面的有效性而經(jīng)常被采用。通常使用的技術(shù)包括離子交換，疏水相互作用，親和，反相和凝膠過濾色譜。反相色譜法已成為多肽和小蛋白質(zhì)分離中最重要的工具。由于它的杰出分離能力，即使多肽只相差一個(gè)氨基酸殘基，也常常可以被分離。此外，反相色譜法使用水混合物作為流動(dòng)相，因此該方法與含水樣品兼容。反相色譜法廣泛用于調(diào)查研究中的雜質(zhì)檢測或治療藥物的大規(guī)模純化中去除不需要的化合物。由于反相色譜法使用極性有機(jī)溶劑作為流動(dòng)相，因此該方法只能用于能夠承受嚴(yán)格條件的化合物。這種類型的色譜通常適用于肽和小的、穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)在純化后會(huì)自發(fā)地重新折疊。

反相色譜法可作為Flash法或高效液相色譜法進(jìn)行。這兩種技術(shù)經(jīng)常被使用，但目的不同：Flash色譜法主要用作純化前步驟，以足夠的分辨率純化大量樣品，而高效液相色譜法的目標(biāo)是在較低上載量的條件下獲得最高的分辨率（純度）。因此這兩種技術(shù)的不同之處在于固定相所用的材料（不同的粒度）、色譜柱的尺寸（內(nèi)徑和長度）和流動(dòng)相的流速。

表1：Flash色譜與高效液相色譜的差異

	Flash色譜	高效液相色譜
粒徑	15-63 μm	5-15 μm
色譜柱直徑	12-115 mm	10-70 mm
流速	15-250 mL/min	5-100 mL/min
上樣量	< 300 g	< 10 g
最大耐壓	50 bar	400 bar

蛋白質(zhì)是復(fù)雜的分子，采用特定的三維結(jié)構(gòu)，由氨基酸殘基和周圍溶劑之間的相互作用決定。這種結(jié)構(gòu)折疊定義了它們的水動(dòng)力半徑，它描述了它們在水溶液中的有效尺寸。在色譜法中，蛋白質(zhì)穿透固定相孔隙的能力直接影響分離效率。色譜介質(zhì)中較大的孔徑允許更好地進(jìn)入固定相，提高蛋白質(zhì)分離的分辨率。固定相的顆粒大小也會(huì)影響蛋白質(zhì)與表面的相互作用。較小的顆粒提供更多的相互作用位點(diǎn)，導(dǎo)致更明顯的分離，而較大的顆粒限制了接觸面積，降低了分辨率。優(yōu)化孔隙和顆粒大小是實(shí)現(xiàn)高效蛋白質(zhì)純化的必要條件。

蛋白質(zhì)在色譜分離過程中的行為在很大程度上受其電荷的影響，這取決于溶劑的pH值。為了保持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，通常在緩沖溶液中進(jìn)行純化，以保持其天然結(jié)構(gòu)。在某些情況下，改變pH值是一種有效的策略，可以改變蛋白質(zhì)的電荷，提高分離效率。

實(shí)驗(yàn)設(shè)備

Pure Excellence C-950 Flash / prep HPLC
PrepPure C18WP (300 ?), 10 μm, 150 x 20 mm
PrepPure C18 (100 ?) , 10 μm, 150 x 20 mm
FlashPure Select C18 (100 ?) 30 μm, 12 g
FlashPure EcoFlex C18 (100 ?), 50 μm, 12 g
離心機(jī)

試劑和材料

試劑：

乙腈，技術(shù)級（VWR）
去離子水
乙酸銨（Riedel de Ha?n）
50克雞蛋

為了安全操作，請注意所有相應(yīng)的MSDS！

示例：

有一個(gè)雞蛋裂開了，蛋白和蛋黃分開了。蛋清在A洗脫液中稀釋至1/3，在3000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下離心15分鐘。A洗脫液稀釋后，蛋清中部分蛋白析出，離心后形成顆粒?；厥丈锨逡河糜谝簶舆M(jìn)樣。

實(shí)驗(yàn)步驟

本研究的色譜圖是在以下實(shí)驗(yàn)條件下生成的：

實(shí)驗(yàn)條件
洗脫液A	水+20 mM 乙酸銨
洗脫液B	80%乙腈/20%水+20 mM 乙酸銨
流速	25 mL/min
ELSD	開啟
UV波長	254 nm, 265 nm, 280 nm, 320 nm
UV掃描	200-800 nm
進(jìn)樣量	高效液相色譜2.5mL，F(xiàn)lash色譜1mL
平衡時(shí)間	高效液相色譜10min，F(xiàn)lash色譜5min

表3. 梯度1

時(shí)長	洗脫液B%
10 min	30-90

表4. 梯度2

時(shí)長	洗脫液B%
3 min	10
3 min	20
4 min	30

表5. 梯度3

時(shí)長	洗脫液B%
1.5 min	10
1.5 min	20
3 min	30

先前的實(shí)驗(yàn)表明，使用PrepPure C18WP （300 ?）柱，10 μm作為固定相，可以實(shí)現(xiàn)最佳的蛋白分離。圖1是樣品的色譜圖，使用PrepPure C18WP （300 ?）， 10 μm，在類似參考文獻(xiàn)的梯度下（梯度1：30%-90%，超過10分鐘）。與參考文獻(xiàn)不同，根據(jù)洗脫順序，只觀察到以下峰：卵泡樣蛋白、卵泡紅蛋白、溶菌酶、卵泡轉(zhuǎn)鐵蛋白和卵泡白蛋白。這些差異可歸因于用于樣品制備的雞蛋的質(zhì)量和來源的差異。

▲ 圖1. 在PrepPure C18WP （300 ?）柱上純化蛋白的色譜圖，10 μm，梯度為1。

為了完善分離條件，我們進(jìn)行了多次實(shí)驗(yàn)，以優(yōu)化目標(biāo)蛋白的分辨率。圖2顯示了PrepPure C18WP （300 ?）， 10 μm，在梯度2：10%，20%和30%下獲得的色譜圖，這有利于目標(biāo)蛋白的分離。

▲ 圖2. 在PrepPure C18WP （300 ?）上純化蛋白的色譜圖，10 μm，梯度2

接下來，以圖2 的實(shí)驗(yàn)條件為參考，研究了孔徑和粒徑的影響。

圖3 為與圖2 相同條件下的色譜圖，使用C18非WP （100 ?）（PrepPure C18, 10 μm）研究孔徑的影響。雖然紫外信號表明與C18WP相比，前兩個(gè)峰的分辨率提高了，但較低的吸光度和ELSD信號表明沒有發(fā)生有效的分離。C18WP的大孔徑（300 ?）使蛋白質(zhì)能夠穿透顆粒并有效地與固定相相互作用。相比之下，PrepPure C18 （100 ?）， 10 μm無法實(shí)現(xiàn)分離，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)只能與顆粒的外表面相互作用。這種有限的相互作用減少了吸附和解吸之間的平衡步驟的數(shù)量，從而影響了分離效率。

▲ 圖3. 在PrepPure C18 （100?）上純化蛋白的色譜圖，10 μm，梯度2

圖4和5 顯示了在與 圖2和圖3 相同的條件下（梯度3），使用Flash色譜柱：FlashPure Select C18 （100 ?）， 30 μm和EcoFlex C18 （100 ?）， 50 μm的色譜圖。當(dāng)顆粒尺寸大于10 μm時(shí)，分離效果不明顯。表面相互作用的減少進(jìn)一步限制了吸附和解吸之間的平衡步驟，使該梯度不足以有效分離。因此所有蛋白質(zhì)以10%的梯度同時(shí)洗脫。此外，隨著顆粒大小的增加，更多的蛋白質(zhì)在10%時(shí)共洗脫，減少了之前觀察到的30%的洗脫。

▲ 圖4. 在FlashPure Select C18 （100 ?）上純化蛋清蛋白的色譜圖，30 μm，梯度3

▲ 圖5. 在FlashPure EcoFlex C18 （100 ?）上純化蛋白的色譜圖，50 μm，梯度3

結(jié)論

蛋清含有多種大分子蛋白，分子量約為14 ~ 80 kDa。這些蛋白質(zhì)的有效分離取決于它們與固定相相互作用的能力，這是通過使用具有大孔和小粒徑的二氧化硅介質(zhì)來增強(qiáng)的。研究表明，當(dāng)與合適的C18WP柱配對時(shí)，Pure Excellence C-950系統(tǒng)可以有效地分離蛋白質(zhì)混合物。只有通過寬孔顆粒（300 ?）、小粒徑顆粒（10 μm）和階躍梯度的組合才能成功分離。對孔徑和粒徑影響的進(jìn)一步研究證實(shí)，只有大孔徑材料才能促進(jìn)蛋白質(zhì)與固定相的充分相互作用，從而實(shí)現(xiàn)有效的分離。此外，大于10 μm的顆粒被證明是不合適的，因?yàn)樗鼈儾惶峁┯行Х纸獾鞍踪|(zhì)成分的必要條件。

參考文獻(xiàn)

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